Control de patógenos de origen telúrico presentes en los cultivos

Con patógenos de origen telúrico o edáfico nos referimos a aquéllos establecidos en plantaciones en suelo natural, suelo modificado o en cultivos sobre sustratos. Se pueden clasificar según afecten a la raíz, cuello o base del tallo, siendo indiferentes a la presencia de agua libre o actuando únicamente en condiciones de encharcamiento, o afectar al sistema vascular, entre los que se encuentran el conocido Verticilium dahliae o la compleja especie denominada Fusarium.

Presencia de sistemas de secreción de patógenos en bacterias endosimbióticas aisladas de Lupinus de la península Ibérica

Los rizobios son bacterias endosimbióticas capaces de fijar nitrógeno en estructuras especializadas de leguminosas. Esta simbiosis es altamente específica y depende, entre otros factores, de la capacidad de los rizobios de secretar proteínas efectoras a las células vegetales. Se han descrito diferentes sistemas de secreción en patógenos animales y vegetales y posteriormente también se han encontrado en algunos rizobios. En este trabajo se presenta el estudio de varios sistemas de secreción identificados en dos cepas LmjC e ISLU101 aisladas de Lupinus marie-josephae y Lupinus angustifolius respectivamente. LmjC posee un sistema de secreción tipo III formado por agrupación de 33 genes cuya expresión dependería del activador transcripcional TtsI mediado a su vez por flavonoides secretados por la planta huésped. La cepa ISLU101 tiene dos sistemas de tipo VI de 19 y 16 genes cada uno. La importancia en la simbiosis de estos sistemas se está estudiando en estos momentos.

Mejora de la eficacia de Penicillium oxalicum como agente de biocontrol en enfermedades de plantas hortícolas

Actualmente, la reducción de materias activas (UE) y la implantación de la nueva Directiva comunitaria 2009/128/ que establece el marco de actuación para conseguir un uso sostenible de los plaguicidas químicos y la preferencia de uso de métodos biológicos, físicos y otros no químicos, obliga a buscar métodos de control menos perjudiciales para el medio ambiente. El control biológico (CB) de enfermedades vegetales empleando agentes de control biológico (ACB) se percibe como una alternativa más segura y con menor impacto ambiental, bien solos o bien como parte de una estrategia de control integrado. El aislado 212 de Penicillium oxalicum (PO212) (ATCC 201888) fue aislado originalmente de la micoflora del suelo en España y ha demostrado ser un eficaz ACB frente a la marchitez vascular del tomate. Una vez identificado y caracterizado el ACB se inició el periodo de desarrollo del mismo poniendo a punto un método de producción en masa de sus conidias. Tras lo cual se inició el proceso de formulación del ACB deshidratando las conidias para su preservación durante un período de tiempo mayor mediante lecho fluido. Finalmente, se han desarrollado algunos formulados que contienen de forma individual diferentes aditivos que han alargado su viabilidad, estabilidad y facilitado su manejo y aplicación. Sin embargo, es necesario seguir trabajando en la mejora de su eficacia de biocontrol. El primer objetivo de esta Tesis se ha centrado en el estudio de la interacción ACB-patógeno-huésped que permita la actuación de P.oxalicum en diferentes patosistemas. Uno de los primeros puntos que se abordan dentro de este objetivo es el desarrollo de nuevas FORMULACIONES del ACB que incrementen su eficacia frente a la marchitez vascular del tomate. Las conidias formuladas de PO212 se obtuvieron por la adición conjunta de distintos aditivos (mojantes, adherentes o estabilizantes) en dos momentos diferentes del proceso de producción/secado: i) antes del proceso de producción (en la bolsa de fermentación) en el momento de la inoculación de las bolsas de fermentación con conidias de PO212 o ii) antes del secado en el momento de la resuspensión de las conidias tras su centrifugación. De las 22 nuevas formulaciones desarrolladas y evaluadas en plantas de tomate en ensayos en invernadero, seis de ellas (FOR22, FOR25, FOR32, FOR35, FOR36 y FOR37) mejoran significativamente (P=0,05) el control de la marchitez vascular del tomate con respecto al obtenido con las conidias secas de P.oxalicum sin aditivos (CSPO) o con el fungicida Bavistin. Los formulados que mejoran la eficacia de las conidias secas sin aditivos son aquellos que contienen como humectantes alginato sódico en fermentación, seguido de aquellos que contienen glicerol como estabilizante en fermentación, y metil celulosa y leche desnatada como adherentes antes del secado. Además, el control de la marchitez vascular del tomate por parte de los formulados de P. oxalicum está relacionado con la fecha de inicio de la enfermedad. Otra forma de continuar mejorando la eficacia de biocontrol es mejorar la materia activa mediante la SELECCIÓN DE NUEVAS CEPAS de P. oxalicum, las cuales podrían tener diferentes niveles de eficacia. De entre las 28 nuevas cepas de P. oxalicum ensayadas en cámara de cultivo, sólo el aislado PO15 muestra el mismo nivel de eficacia que PO212 (62-67% de control) frente a la marchitez vascular del tomate en casos de alta presión de enfermedad. Mientras que, en casos de baja presión de enfermedad todas las cepas de P. oxalicum y sus mezclas demuestran ser eficaces. Finalmente, se estudia ampliar el rango de actuación de este ACB a OTROS HUÉSPEDES Y OTROS PATÓGENOS Y DIFERENTES GRADOS DE VIRULENCIA. En ensayos de eficacia de P. oxalicum frente a aislados de diferente agresividad de Verticillium spp. y Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en plantas de tomate en cámaras de cultivo, se demuestra que la eficacia de PO212 está negativamente correlacionada con el nivel de enfermedad causada por F. oxysporum f. sp. lycopersici pero que no hay ningún efecto diferencial en la reducción de la incidencia ni de la gravedad según la virulencia de los aislados. Sin embargo, en los ensayos realizados con V. dahliae, PO212 causa una mayor reducción de la enfermedad en las plantas inoculadas con aislados de virulencia media. La eficacia de PO212 también era mayor frente a aislados de virulencia media alta de F. oxysporum f. sp. melonis y F. oxysporum f. sp. niveum, en plantas de melón y sandía, respectivamente. En ambos huéspedes se demuestra que la dosis óptima de aplicación del ACB es de 107 conidias de PO212 g-1 de suelo de semillero, aplicada 7 días antes del trasplante. Además, entre 2 y 4 nuevas aplicaciones de PO212 a la raíces de las plantas mediante un riego al terreno de asiento mejoran la eficacia de biocontrol. La eficacia de PO212 no se limita a hongos patógenos vasculares como los citados anteriormente, sino también a otros patógenos como: Phytophthora cactorum, Globodera pallida y G. rostochiensis. PO212 reduce significativamente los síntomas (50%) causados por P. cactorum en plantas de vivero de fresa, tras la aplicación del ACB por inmersión de las raíces antes de su trasplante al suelo de viveros comerciales. Por otra parte, la exposición de los quistes de Globodera pallida y G. rostochiensis (nematodos del quiste de la patata) a las conidias de P. oxalicum, en ensayos in vitro o en microcosmos de suelo, reduce significativamente la capacidad de eclosión de los huevos. Para G. pallida esta reducción es mayor cuando se emplean exudados de raíz de patata del cv. 'Monalisa', que exudados de raíz del cv. 'Desirée'. No hay una reducción significativa en la tasa de eclosión con exudados de raíz de tomate del cv. 'San Pedro'. Para G. rostochiensis la reducción en la tasa de eclosión de los huevos se obtiene con exudados de la raíz de patata del cv. 'Desirée'. El tratamiento con P. oxalicum reduce también significativamente el número de quistes de G. pallida en macetas. Con el fin de optimizar la aplicación práctica de P. oxalicum cepa 212 como tratamiento biológico del suelo, es esencial entender cómo el entorno físico influye en la capacidad de colonización, crecimiento y supervivencia del mismo, así como el posible riesgo que puede suponer su aplicación sobre el resto de los microorganismos del ecosistema. Por ello en este segundo objetivo de esta tesis se estudia la interacción del ACB con el medio ambiente en el cual se aplica. Dentro de este objetivo se evalúa la INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA, DISPONIBILIDAD DE AGUA Y PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS SUELOS (POROSIDAD, TEXTURA, DENSIDAD...) SOBRE LA SUPERVIVENCIA Y EL CRECIMIENTO DE PO212 en condiciones controladas elaborando modelos que permitan predecir el impacto de cada factor ambiental en la supervivencia y crecimiento de P. oxalicum y conocer su capacidad para crecer y sobrevivir en diferentes ambientes. En las muestras de suelo se cuantifica: i) la supervivencia de Penicillium spp. usando el recuento del número de unidades formadoras de colonias en un medio de cultivo semi-selectivo y ii) el crecimiento (biomasa) de PO212 mediante PCR en tiempo real. En los resultados obtenidos se demuestra que P. oxalicum crece y sobrevive mejor en condiciones de sequía independientemente de la temperatura y del tipo de suelo. Si comparamos tipos de suelo P. oxalicum crece y sobrevive en mayor medida en suelos areno-arcillosos con un bajo contenido en materia orgánica, un mayor pH y una menor disponibilidad de fósforo y nitrógeno. La supervivencia y el crecimiento de P. oxalicum se correlaciona de forma negativa con la disponibilidad de agua y de forma positiva con el contenido de materia orgánica. Sólo la supervivencia se correlaciona también positivamente con el pH. Por otro lado se realizan ensayos en suelos de huertos comerciales con diferentes propiedades físico-químicas y diferentes condiciones ambientales para ESTUDIAR EL ESTABLECIMIENTO, SUPERVIVENCIA Y DISPERSIÓN VERTICAL Y MOVILIDAD HORIZONTAL DE PO212. P. oxalicum 212 puede persistir y sobrevivir en esos suelos al menos un año después de su liberación pero a niveles similares a los de otras especies de Penicillium indígenas presentes en los mismos suelos naturales. Además, P. oxalicum 212 muestra una dispersión vertical y movilidad horizontal muy limitada en los diferentes tipos de suelo evaluados. La introducción de P. oxalicum en un ambiente natural no sólo implica su actuación sobre el microorganismo diana, el patógeno, si no también sobre otros microorganismos indígenas. Para EVALUAR EL EFECTO DE LA APLICACIÓN DE P. oxalicum SOBRE LAS POBLACIONES FÚNGICAS INDIGENAS PRESENTES EN EL SUELO de dos huertos comerciales, se analizan mediante electroforesis en gradiente desnaturalizante de poliacrilamida (DGGE) muestras de dichos suelos a dos profundidades (5 y 10 cm) y a cuatro fechas desde la aplicación de P. oxalicum 212 (0, 75, 180 y 365 días). El análisis de la DGGE muestra que las diferencias entre las poblaciones fúngicas se deben significativamente a la fecha de muestreo y son independientes del tratamiento aplicado y de la profundidad a la que se tomen las muestras. Luego, la aplicación del ACB no afecta a la población fúngica de los dos suelos analizados. El análisis de las secuencias de la DGGE confirma los resultados anteriores y permiten identificar la presencia del ACB en los suelos. La presencia de P. oxalicum en el suelo se encuentra especialmente relacionada con factores ambientales como la humedad. Por tanto, podemos concluir que Penicillium oxalicum cepa 212 puede considerarse un óptimo Agente de Control Biológico (ACB), puesto que es ecológicamente competitivo, eficaz para combatir un amplio espectro de enfermedades y no supone un riesgo para el resto de microorganismos fúngicos no diana presentes en el lugar de aplicación. ABSTRACT Currently, reduction of active (EU) and the implementation of the new EU Directive 2009/128 which establishing the framework for action to achieve the sustainable use of chemical pesticides and preference of use of biological, physical and other non-chemical methods, forces to look for control methods less harmful to the environment. Biological control (CB) of plant diseases using biological control agents (BCA) is perceived as a safer alternative and with less environmental impact, either alone or as part of an integrated control strategy. The isolate 212 of Penicillium oxalicum (PO212) (ATCC 201888) was originally isolated from the soil mycoflora in Spain. P. oxalicum is a promising biological control agent for Fusarium wilt and other tomato diseases. Once identified and characterized the BCA, was developed a mass production method of conidia by solid-state fermentation. After determined the process of obtaining a formulated product of the BCA by drying of product by fluid-bed drying, it enables the preservation of the inoculum over a long period of time. Finally, some formulations of dried P. oxalicum conidia have been developed which contain one different additive that have improved their viability, stability and facilitated its handling and application. However, further work is needed to improve biocontrol efficacy. The first objective of this thesis has focused on the study of the interaction BCA- pathogen-host, to allow P.oxalicum to work in different pathosystems. The first point to be addressed in this objective is the development of new FORMULATIONS of BCA which increase their effectiveness against vascular wilt of tomato. PO212 conidial formulations were obtained by the joint addition of various additives (wetting agents, adhesives or stabilizers) at two different points of the production-drying process: i) to substrate in the fermentation bags before the production process, and (ii) to conidial paste obtained after production but before drying. Of the 22 new formulations developed and evaluated in tomato plants in greenhouse tests, six of them (FOR22 , FOR25 , FOR32 , FOR35 , FOR36 and FOR3) improved significantly (P = 0.05) the biocontrol efficacy against tomato wilt with respect to that obtained with dried P.oxalicum conidia without additives (CSPO) or the fungicide Bavistin. The formulations that improve the efficiency of dried conidia without additives are those containing as humectants sodium alginate in the fermentation bags, followed by those containing glycerol as a stabilizer in the fermentation bags, and methylcellulose and skimmed milk as adherents before drying. Moreover, control of vascular wilt of tomatoes by PO212 conidial formulations is related to the date of disease onset. Another way to further improve the effectiveness of biocontrol is to improve the active substance by SELECTION OF NEW STRAINS of P. oxalicum, which may have different levels of effectiveness. Of the 28 new strains of P. oxalicum tested in a culture chamber, only PO15 isolate shows the same effectiveness that PO212 (62-67 % of control) against tomato vascular wilt in cases of high disease pressure. Whereas in cases of low disease pressure all strains of P. oxalicum and its mixtures effective. Finally, we study extend the range of action of this BCA TO OTHER GUESTS AND OTHER PATHOGENS AND DIFFERENT DEGREES OF VIRULENCE. In efficacy trials of P. oxalicum against isolates of different aggressiveness of Verticillium spp. and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in tomato plants in growth chambers, shows that the efficiency of PO212 is negatively correlated with the level of disease caused by F. oxysporum f. sp. lycopersici. There is not differential effect in reducing the incidence or severity depending on the virulence of isolates. However, PO212 cause a greater reduction of disease in plants inoculated with virulent isolates media of V. dahlia. PO212 efficacy was also higher against isolates of high and average virulence of F. oxysporum f. sp. melonis and F. oxysporum f. sp. niveum in melon and watermelon plants, respectively. In both hosts the optimum dose of the BCA application is 107 conidia PO212 g-1 soil, applied on seedlings 7 days before transplantation into the field. Moreover, the reapplication of PO212 (2-4 times) to the roots by irrigation into the field improve efficiency of biocontrol. The efficacy of PO212 is not limited to vascular pathogens as those mentioned above, but also other pathogens such as Oomycetes (Phytophthora cactorum) and nematodes (Globodera pallida and G. rostochiensis). PO212 significantly reduces symptoms (50 %) caused by P. cactorum in strawberry nursery plants after application of BCA by dipping the roots before transplanting to soil in commercial nurseries. Moreover, the exposure of G. pallida and G. rostochiensis cysts to the conidia of P. oxalicum, in in vitro assays or in soil microcosms significantly reduces hatchability of eggs. The reduction in the rate of G. pallida juveniles hatching was greatest when root diffusates from the `Monalisa´ potato cultivar were used, followed by root diffusates from the `Désirée´ potato cultivar. However, no significant reduction in the rate of G. pallida juveniles hatching was found when root diffusates from the ‘San Pedro” tomato cultivar were used. For G. rostochiensis reduction in the juveniles hatching is obtained from the root diffusates 'Desirée' potato cultivar. Treatment with P. oxalicum also significantly reduces the number of cysts of G. pallida in pots. In order to optimize the practical application of P. oxalicum strain 212 as a biological soil treatment, it is essential to understand how the physical environment influences the BCA colonization, survival and growth, and the possible risk that can cause its application on other microorganisms in the ecosystem of performance. Therefore, the second objective of this thesis is the interaction of the BCA with the environment in which it is applied. Within this objective is evaluated the INFLUENCE OF TEMPERATURE, WATER AVAILABILITY AND PHYSICAL-CHEMICAL PROPERTIES OF SOILS (POROSITY, TEXTURE, DENSITY...) ON SURVIVAL AND GROWTH OF PO212 under controlled conditions to develop models for predicting the environmental impact of each factor on survival and growth of P. oxalicum and to know their ability to grow and survive in different environments. Two parameters are evaluated in the soil samples: i) the survival of Penicillium spp. by counting the number of colony forming units in semi-selective medium and ii) growth (biomass) of PO212 by real-time PCR. P. oxalicum grows and survives better in drought conditions regardless of temperature and soil type. P. oxalicum grows and survives more in sandy loam soils with low organic matter content, higher pH and lower availability of phosphorus and nitrogen. Survival and growth of P. oxalicum negatively correlates with the availability of water and positively with the organic content. Only survival also correlated positively with pH. Moreover, trials are carried out into commercial orchards soils with different physic-chemical properties and different environmental conditions TO STUDY THE ESTABLISHMENT, SURVIVAL, VERTICAL DISPERSION AND HORIZONTAL SPREAD OF PO212. P. oxalicum 212 can persist and survive at very low levels in soil one year after its release. The size of the PO212 population after its release into the tested natural soils is similar to that of indigenous Penicillium spp. Furthermore, the vertical dispersion and horizontal spread of PO212 is limited in different soil types. The introduction of P. oxalicum in a natural environment not only involves their action on the target organism, the pathogen, but also on other indigenous microorganisms. TO ASSESS THE EFFECT OF P. oxalicum APPLICATION ON SOIL INDIGENOUS FUNGAL COMMUNITIES in two commercial orchards, soil samples are analyzed by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis polyacrylamide (DGGE). Samples are taken from soil at two depths (5 and 10 cm) and four dates from the application of P. oxalicum 212 (0, 75, 180 and 365 days). DGGE analysis shows that differences are observed between sampling dates and are independent of the treatment of P. oxalicum applied and the depth. BCA application does not affect the fungal population of the two soil analyzed. Sequence analysis of the DGGE bands confirms previous findings and to identify the presence of BCA on soils. The presence of P. oxalicum in soil is especially related to environmental factors such as humidity. Therefore, we conclude that the 212 of strain Penicillium oxalicum can be considered an optimum BCA, since it is environmentally competitive and effective against a broad spectrum of diseases and does not have any negative effect on soil non-target fungi communities.

Functional characterization of YODA, a mitogen-activated protein kinase kinase kinase (MAP3K) that regulates a novel innate immunity pathway in Arabidopsis thaliana

Las cascadas de señalización mediadas por proteína quinasas activadas por mitógeno (MAP quinasas) son capaces de integrar y transducir señales ambientales en respuestas celulares. Entre estas señales se encuentran los PAMPs/MAMPs (Pathogen/Microbe-Associated Molecular Patterns), que son moléculas de patógenos o microorganismos, o los DAMPs (Damaged-Associated Molecular Patterns), que son moléculas derivadas de las plantas producidas en respuesta a daño celular. Tras el reconocimiento de los PAMPs/DAMPs por receptores de membrana denominados PRRs (Pattern Recognition Receptors), como los receptores con dominio quinasa (RLKs) o los receptores sin dominio quinasa (RLPs), se activan respuestas moleculares, incluidas cascadas de MAP quinasas, que regulan la puesta en marcha de la inmunidad activada por PAMPs (PTI). Esta Tesis describe la caracterización funcional de la MAP quinasa quinasa quinasa (MAP3K) YODA (YDA), que actúa como un regulador clave de la PTI en Arabidopsis. Se ha descrito previamente que YDA controla varios procesos de desarrollo, como la regulación del patrón estomático, la elongación del zigoto y la arquitectura floral. Hemos caracterizado un alelo mutante hipomórfico de YDA (elk2 o yda11) que presenta una elevada susceptibilidad a patógenos biótrofos y necrótrofos. Notablemente, plantas que expresan una forma constitutivamente activa de YDA (CA-YDA), con una deleción en el dominio N-terminal, presentan una resistencia de amplio espectro frente a diferentes tipos de patógenos, incluyendo hongos, oomicetos y bacterias, lo que indica que YDA juega un papel importante en la regulación de la resistencia de las plantas a patógenos. Nuestros datos indican que esta función es independiente de las respuestas inmunes mediadas por los receptores previamente caracterizados FLS2 y CERK1, que reconocen los PAMPs flg22 y quitina, respectivamente, y que están implicados en la resistencia de Arabidopsis frente a bacterias y hongos. Hemos demostrado que YDA controla la resistencia frente al hongo necrótrofo Plectosphaerella cucumerina y el patrón estomático mediante su interacción genética con la RLK ERECTA (ER), un PRR implicado en la regulación de estos procesos. Por el contrario, la interacción genética entre ER y YDA en la regulación de otros procesos de desarrollo es aditiva en lugar de epistática. Análisis genéticos indicaron que MPK3, una MAP quinasa que funciona aguas abajo de YDA en el desarrollo estomático, es un componente de la ruta de señalización mediada por YDA para la resistencia frente a P. cucumerina, lo que sugiere que el desarrollo de las plantas y la PTI comparten el módulo de transducción de MAP quinasas asociado a YDA. Nuestros experimentos han revelado que la resistencia mediada por YDA es independiente de las rutas de señalización reguladas por las hormonas de defensa ácido salicílico, ácido jasmónico, ácido abscísico o etileno, y también es independiente de la ruta de metabolitos secundarios derivados del triptófano, que están implicados en inmunidad vegetal. Además, hemos demostrado que respuestas asociadas a PTI, como el aumento en la concentración de calcio citoplásmico, la producción de especies reactivas de oxígeno, la fosforilación de MAP quinasas y la expresión de genes de defensa, no están afectadas en el mutante yda11. La expresión constitutiva de la proteína CA-YDA en plantas de Arabidopsis no provoca un aumento de las respuestas PTI, lo que sugiere la existencia de mecanismos de resistencia adicionales regulados por YDA que son diferentes de los regulados por FLS2 y CERK1. En línea con estos resultados, nuestros datos transcriptómicos revelan una sobre-representación en plantas CA-YDA de genes de defensa que codifican, por ejemplo, péptidos antimicrobianos o reguladores de muerte celular, o proteínas implicadas en la biogénesis de la pared celular, lo que sugiere una conexión potencial entre la composición e integridad de la pared celular y la resistencia de amplio espectro mediada por YDA. Además, análisis de fosfoproteómica indican la fosforilación diferencial de proteínas relacionadas con la pared celular en plantas CA-YDA en comparación con plantas silvestres. El posible papel de la ruta ER-YDA en la regulación de la integridad de la pared celular está apoyado por análisis bioquímicos y glicómicos de las paredes celulares de plantas er, yda11 y CA-YDA, que revelaron cambios significativos en la composición de la pared celular de estos genotipos en comparación con la de plantas silvestres. En resumen, nuestros datos indican que ER y YDA forman parte de una nueva ruta de inmunidad que regula la integridad de la pared celular y respuestas defensivas, confiriendo una resistencia de amplio espectro frente a patógenos. ABSTRACT Plant mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades transduce environmental signals and developmental cues into cellular responses. Among these signals are the pathogen- or microbe-associated molecular patterns (PAMPs or MAMPs) and the damage-associated molecular patterns (DAMPs). These PAMPs/DAMPs, upon recognition by plant pattern recognition receptors (PRRs), such as Receptor-Like Kinases (RLKs) and Receptor-Like Proteins (RLPs), activate molecular responses, including MAPK cascades, which regulate the onset of PAMP-triggered immunity (PTI). This Thesis describes the functional characterization of the MAPK kinase kinase (MAP3K) YODA (YDA) as a key regulator of Arabidopsis PTI. YDA has been previously described to control several developmental processes, such as stomatal patterning, zygote elongation and inflorescence architecture. We characterized a hypomorphic, non-embryo lethal mutant allele of YDA (elk2 or yda11) that was found to be highly susceptible to biotrophic and necrotrophic pathogens. Remarkably, plants expressing a constitutive active form of YDA (CA-YDA), with a deletion in the N-terminal domain, showed broad-spectrum resistance to different types of pathogens, including fungi, oomycetes and bacteria, indicating that YDA plays a relevant function in plant resistance to pathogens. Our data indicated that this function is independent of the immune responses regulated by the well characterized FLS2 and CERK1 RLKs, which are the PRRs recognizing flg22 and chitin PAMPs, respectively, and are required for Arabidopsis resistance to bacteria and fungi. We demonstrate that YDA controls resistance to the necrotrophic fungus Plectosphaerella cucumerina and stomatal patterning by genetically interacting with ERECTA (ER) RLK, a PRR involved in regulating these processes. In contrast, the genetic interaction between ER and YDA in the regulation of other ER-associated developmental processes was additive, rather than epistatic. Genetic analyses indicated that MPK3, a MAP kinase that functions downstream of YDA in stomatal development, also regulates plant resistance to P. cucumerina in a YDA-dependent manner, suggesting that the YDA-associated MAPK transduction module is shared in plant development and PTI. Our experiments revealed that YDA-mediated resistance was independent of signalling pathways regulated by defensive hormones like salicylic acid, jasmonic acid, abscisic acid or ethylene, and of the tryptophan-derived metabolites pathway, which are involved in plant immunity. In addition, we showed that PAMP-mediated PTI responses, such as the increase of cytoplasmic Ca2+ concentration, reactive oxygen species (ROS) burst, MAPK phosphorylation, and expression of defense-related genes are not impaired in the yda11 mutant. Furthermore, the expression of CA-YDA protein does not result in enhanced PTI responses, further suggesting the existence of additional mechanisms of resistance regulated by YDA that differ from those regulated by the PTI receptors FLS2 and CERK1. In line with these observations, our transcriptomic data revealed the over-representation in CA-YDA plants of defensive genes, such as those encoding antimicrobial peptides and cell death regulators, and genes encoding cell wall-related proteins, suggesting a potential link between plant cell wall composition and integrity and broad spectrum resistance mediated by YDA. In addition, phosphoproteomic data revealed an over-representation of genes encoding wall-related proteins in CA-YDA plants in comparison with wild-type plants. The putative role of the ER-YDA pathway in regulating cell wall integrity was further supported by biochemical and glycomics analyses of er, yda11 and CA-YDA cell walls, which revealed significant changes in the cell wall composition of these genotypes compared with that of wild-type plants. In summary, our data indicate that ER and YDA are components of a novel immune pathway that regulates cell wall integrity and defensive responses, which confer broad-spectrum resistance to pathogens.

Optimización de la aplicación de lodos de depuración de aguas residuales al abonado o mejora de suelos

El objetivo de este trabajo de investigación fue evaluar el efecto de la aplicación de lodos residuales procedentes de una planta de tratamiento de aguas residuales acondicionados como biosólido para el abonado de tres cultivos agrícolas. Esto se realizó a través del estudio de las variables de producción (desarrollo vegetal de cada cultivo) y de la comparación de las características de los suelos utilizados antes y después de los ensayos experimentales. A través de la investigación se confirmó la mejora en la calidad del suelo y mejor rendimiento de cultivo debido a los biosólidos procedentes de tratamiento de aguas residuales. Este trabajo de investigación de tipo descriptivo y experimental, utilizó lodos optimizados que fueron aplicados a tres cultivos agrícolas de ciclo corto. Fueron evaluados dos cultivos (sandía y tomate) bajo riego y un cultivo (arroz) en secano. En la primera fase del trabajo se realizó la caracterización de los lodos, para ellos se realizaron pruebas físico químicas y microbiológicas. Fue utilizado el método de determinación de metales por espectrometría de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente, (ICP-AES) para conocer las concentraciones de metales. La caracterización microbiológica para coliformes totales y fecales se realizó utilizando la técnica del Número más probable (NMP), y para la identificación de organismos patógenos se utilizó el método microbiológico propuesto por Kornacki & Johnson (2001), que se fundamenta en dos procesos: pruebas presuntivas y prueba confirmativa. Tanto los resultados para la determinación de metales y elementos potencialmente tóxicos; como las pruebas para la determinación de microorganismos potencialmente peligrosos, estuvieron por debajo de los límites considerados peligrosos establecidos por la normativa vigente en Panama (Reglamento Técnico COPANIT 47-2000). Una vez establecido la caracterización de los lodos, se evalúo el potencial de nutrientes (macro y micro) presentes en los biosólidos para su potencial de uso como abono en cultivos agrícolas. El secado de lodos fue realizado a través de una era de secado, donde los lodos fueron deshidratados hasta alcanzar una textura pastosa. “La pasta de lodo” fue transportada al área de los ensayos de campo para continuar el proceso de secado y molida. Tres ensayos experimentales fueron diseñados al azar con cinco tratamientos y cuatro repeticiones para cada uno de los tres cultivos: sandía, tomate, arroz, en parcelas de 10m2 (sandía y tomate) y 20 m2 (arroz) para cada tratamiento. Tres diferentes dosis de biosólidos fueron evaluadas y comparadas con un tratamiento de fertilizante comercial y un tratamiento control. La dosis de fertilizante comercial utilizada en cada cultivo fue la recomendada por el Instituto de Investigación Agropecuaria de Panamá. Los ensayos consideraron la caracterización inicial del suelo, la preparación del suelo, semilla, y arreglo topográfico de los cultivos siguiendo las recomendaciones agronómicas de manejo de cultivo establecida por el Instituto de Investigación Agropecuaria. Para los ensayos de sandía y tomate se instaló el sistema de riego por goteo. Se determinaron los ácidos húmicos presentes en los cultivos, y se estudiaron las variables de desarrollo de cada cultivo (fructificación, cosecha, peso de la cosecha, dimensiones de tamaño y color de las frutas, rendimiento, y la relación costo – rendimiento). También se estudiaron las variaciones de los macro y micro nutrientes y las variaciones de pH, textura de suelo y MO disponible al inicio y al final de cada uno de los ensayos de campo. Todas las variables y covariables fueron analizadas utilizando el programa estadístico INFOSAT (software para análisis estadístico de aplicación general) mediante el análisis de varianza, el método de comparaciones múltiples propuesto por Fisher (LSD Fisher) para comparar las medias de los cultivares y el coeficiente de correlación de Pearson que nos permite analizar si existe una asociación lineal entre dos variables. En la evaluación de los aportes del biosólido a los cultivos se observó que los macronutrientes N y P se encontraban de los límites requeridos en cada uno de los cultivos, pero que los niveles de K estuvieron por debajo de los requerimientos de los cultivos. A nivel de la fertilización tradicional con fertilizante químico se observó que la dosis recomendada para cada uno de los cultivos del estudio estaba sobreestimada en los tres principales macronutrientes: Nitrógeno, Fosforo y Potasio. Contenían concentraciones superiores de N, P y K a las requeridas teóricamente por el cultivo. El nutriente que se aporta en exceso es el Fósforo. Encontramos que para el cultivo de sandía era 18 veces mayor a lo requerido por el cultivo, en tomate fue 12 veces mayor y en el cultivo de arroz, 34 veces mayor. El fertilizante comercial tuvo una influencia en el peso final y rendimiento final en cada uno de los cultivos del estudio. A diferencia, los biosólidos tuvieron una influencia directa en el desarrollo de los cultivos (germinación, coloración, tamaño, longitud, diámetro, floración y resistencia a enfermedades). Para el caso de la sandía la dosis de biosólido más cercana al óptimo para el cultivo es la mayor dosis aplicada en este ensayo (97.2 gramos de biosólido por planta). En el caso de tomate, el fertilizante comercial obtuvo los mejores valores, pero las diferencias son mínimas con relación al tratamiento T1, de menor dosis de biosólido (16.2 gramos de biosólido por planta). Los resultados generales del ensayo de tomate estuvieron por debajo del rendimiento esperado para el cultivo. Los tratamientos de aplicación de biosólidos aportaron al desarrollo del cultivo en las variables tamaño, color y resistencia a las enfermedades dentro del cultivo de tomate. Al igual que el tomate, en el caso del arroz, el tratamiento comercial obtuvo los mejores resultados. Los resultados finales de peso y rendimiento del cultivo indican que el tratamiento (T2), menor dosis de biosólido (32.4 gramos por parcela), no tuvo diferencias significativas con los resultados obtenidos en las parcelas con aplicación de fertilizante comercial (T1). El tratamiento T4 (mayor dosis de biosólido) obtuvo los mejores valores para las variables germinación, ahijamiento y espigamiento del cultivo, pero al momento de la maduración obtuvo los menores resultados. Los biosólidos aportan nutrientes a los cultivos y al final del ensayo se observó que permanecen disponibles en el suelo, aportando a la mejora del suelo final. En los tres ensayos, se pudo comprobar que los aportes de los biosólidos en el desarrollo vegetativo de los cultivos. También se encontró en todos los ensayos que no hubo diferencias significativas (p > 0.05) entre los tratamientos de biosólidos y fertilizante comercial. Para obtener mejores resultados en estos tres ensayos se requeriría que a la composición de biosólidos (utilizada en este ensayo) se le adicione Potasio, Calcio y Magnesio en las cantidades requeridas por cada uno de los cultivos. ABSTRACT The objective of this investigation was to evaluate the effect of residual sewage sludge obtained from the residual water of a treatment plant conditioned as Biosolid used on three reliable agricultural crops. The effect of the added sewage sludge was evaluated through the measurement of production variables such as crop plant development and the comparison of the soil characteristics used before and after the experimental tests. This investigation confirmed that biosolids from wastewater treatment can contribute to the growth of these crops. In this experimental approach, optimized sludge was applied to three short-cycle crops including two low-risk crops (watermelon and tomato) and one high-risk crop (rice) all grown on dry land. In the first phase of work, the characteristics of the sludge were assessed using chemical, physical and microbiological tests. The concentrations of metals were determined by atomic emission spectrometry inductively coupled plasma, (ICP-AES). Microbiological characterization was performed measuring total coliform and fecal count using the most probable number technique (NMP) and microbiological pathogens were identified using Kornacki & Johnson (2001) method based on two processes: presumptive and confirmatory tests. Both the results for the determination of metals and potentially toxic elements, as testing for the determination of potentially dangerous microorganisms were below the limits established by the applicable standard in Panama (Technical Regulate COPANIT 47-2000). After the metal and bacterial characterization of the sludge, the presence of macro or micronutrients in biosolids was measured to evaluate its potential for use as fertilizer in the growth of agricultural crops. The sludge was dehydrated via a drying process into a muddy slurry. The pulp slurry was transported to the field trial area to continue the process of drying and grinding. Three randomized experimental trials were designed to test with five treatment regimens and four replications for each of the crops: watermelon, tomato, rice. The five treatment regimens evaluated were three different doses of bio solid with commercial fertilizer treatment control and no fertilizer treatment control. Treatment areas for the watermelon and tomato were 10m2 plots land and for rice was 20m2. The amount of commercial fertilizer used to treat each crop was based on the amount recommended by Agricultural Research Institute of Panama. The experimental trials considered initial characterization of soil, soil preparation, seed, and crop topographical arrangement following agronomic crop management recommendations. For the tests evaluating the growth of watermelons and tomatoes and drip irrigation system was installed. The amount of humic acids present in the culture were determined and developmental variable of each crop were studied (fruiting crop harvest weight, size dimensions and color of the fruit, performance and cost effectiveness). Changes in macro and micronutrients and changes in pH, soil texture and OM available were measured at the beginning and end of each field trial. All variables and covariates were analyzed using INFOSAT statistical program (software for statistical analysis of general application) by analysis of variance, multiple comparisons method as proposed by Fisher (LSD Fisher) to compare the means of cultivars and the Pearson ratio that allows us to analyze if there is a linear association between two variables. In evaluating the contribution of biosolids to agricultural crops, the study determined that the macronutrients N & P were within the requirements of crops, but K levels were below the requirements of crops. In terms of traditional chemical fertilizer fertilization, we observed that the recommended dose for each study crop was overestimated for the three major nutrients: nitrogen, phosphorus and potassium. Higher concentrations containing N, P and K to the theoretically required by the crop. The recommended dose of commercial fertilizer for crops study contained greater amounts of phosphorus, crops that need. The level of phosphorous was found to be18 times greater than was required for the cultivation of watermelon; 12 times higher than required for tomato, and 34 times higher than required for rice cultivation. Phosphorus inputs of commercial fertilizer were a primary influence on the weight and performance of each crop. Unlike biosolids had a direct influence on crop development (germination, color, size, length, diameter, flowering and disease resistance). In the case of growth of watermelons, the Biosolid dose closest to the optimum for cultivation was applied the highest dose in this assay (97.2 grams of bio solids per plant). In the case of tomatoes, commercial fertilizer had the best values but the differences were minimal when compared to treatment T1, the lower dose of sewage sludge (Biosolid 16.2 grams per plant). The overall results for the tomato crop yield of the trial were lower than expected. Additionally, the application of biosolids treatment contributed to the development of fruit of variable size, color and disease resistance in the tomato crops. Similar to the tomato crop, commercial fertilizer treatment provided the best results for the rice crop. The final results of weight and crop yield for rice indicated that treatment with T2 amount of biosolids (34.2 grams per plot) was not significantly different from the result obtained in the application plot given commercial fertilizer (T1). The T4 (higher dose of bio solid) treatment had the best values for the germination, tillering and bolting variables of the rice crop but for fruit ripening yielded lower results. In all three trials, biosolids demonstrated the ability to contribute in the vegetative growth of crops. It was also found in all test no significant differences (p>0.05) between treatment of bio solid and commercial fertilizer. Biosolids provided nutrients to the crops and even at the end of the trial remained available in the ground soil, contributing to the improvement of the final ground. The best results from these three trials is that the use of bio solids such as those used in this assay would require the addition of potassium, calcium and magnesium in quantities required for each crop.